Noi:LabNotes/2010-10-21: Difference between revisions

From ZhangLabWiki
Jump to navigation Jump to search
>Noi
No edit summary
>Noi
No edit summary
Line 56: Line 56:
   Total amount of ss amplicon                  18.3ug                                    17.1ug
   Total amount of ss amplicon                  18.3ug                                    17.1ug
   - 37C 1hr
   - 37C 1hr
   - Add  
   - Add                                                                                                   prepare rxn mix for 6.1x
         10x DpnII buffer                      10ul                                      10ul
         10x DpnII buffer                      10ul                                      10ul                     61ul
         100uM RE-DpnII-V66 guide oligo        5ul                                        5ul
         100uM RE-DpnII-V66 guide oligo        5ul                                        5ul                      30.5ul
   - 94C 2min, 37C 3min
   - 94C 2min, 37C 3min                                                                                             - mix and aliquot 15ul to each tube
   - Add DpnII                                  5ul                                        5 ul
   - Add DpnII                                  5ul                                        5 ul
   - 37C 3hr
   - 37C 3hr
   - Add  
   - Add                                                                                                   prepare rxn mix for 6.1x
         USER                                  5ul                                        5ul
         USER                                  5ul                                        5ul                     30.5ul                 
         10x DpnII buffer                      10ul                                      10ul
         10x DpnII buffer                      10ul                                      10ul                     61ul
         H2O                                    85ul                                      85ul
         H2O                                    85ul                                      85ul                     518.5ul                 
   - 37C O/N
   - 37C O/N                                                                                                       - mix and aliquot 100ul to each tube
   - 75C 20min
   - 75C 20min



Revision as of 18:16, 23 October 2010

Probe prep for the DMR220k S4 and S5

(followed Dr. Zhang's conditions)

Production PCR

                                                         98rxn mix
   10nM 1st round amplicon      0.2ul                     19.6ul               
   2x Kapa SYBG qPCR Master Mix  50ul                     4900ul
   100uM pAP1V61U               0.4ul                     39.2ul
   100uM AP2V6                  0.4ul                     39.2ul
   H2O                           49ul                     4802ul   
   ===================================
                                100ul x 96
   95C 30sec 
   (95C 3sec -> 55C 30sec-> 60C 20sec) x 15 cycles
   60C 2min  
   15C hold.
   
   - Ethanol precipitation
   - Re-purified with twelve Qiaquick columns
   - Each eluted with 41ul EB (total vol: 12 x 41 = 492ul).
                                            DMR220k_S4                             DMR220k_S5
  Amplified amplicon conc. (ng/ul)            194.2                                    192.7                                                
  O.D.260/280                                 1.93                                     1.92                             
  Yield: conc. x total vol. 194.2ng/ulx492ul= 95.5ug                192.7ng/ulx492ul = 94.8ug

Lambda exo digestion

                                            DMR220k_S4                             DMR220k_S5
    Qiaquick (QQ)amplified amplicon           108ul (21.0ug)                            108ul (20.8ug)
    10x Lambda Exo buffer                     15ul                                      15ul
    Lambda exo                                10ul                                      10ul
    H20                                       17ul                                      17ul
                                              -----------------------------------------------------
    Total                                     100ul x 4.5                               100ul x 4.5
    Total amount of QQ amplified amplicon     94.4ug                                    93.6ug
  
   - 37C 1h 
   - Purified with four Qiaquick columns
   - Each eluted with 60ul EB (total vol: 4 x 60 = 240ul)


                                            DMR220k_S4                             DMR220k_S5                                         
   Single-strand(SS) amplicon conc. (ng/ul)    81.3                                      75.9                                                    
   O.D.260/280                                 1.96                                      1.96                                
   Yield: conc. x total vol. 81.3ng/ulx240ul = 19.5ug                  75.9ng/ulx240ul = 18.2ug

Removal of amplification adaptors

                                            DMR220k_S4                             DMR220k_S5    
  ss-amplicon                                  75ul (6.1ug)                               75ul (5.7ug)
  USER                                         5ul                                        5ul
                                               -----------------------------------------------------
  Total                                        80ul x 3                                   80ul x 3
  Total amount of ss amplicon                  18.3ug                                     17.1ug
  - 37C 1hr
  - Add                                                                                                    prepare rxn mix for 6.1x
        10x DpnII buffer                       10ul                                       10ul                     61ul
        100uM RE-DpnII-V66 guide oligo         5ul                                        5ul                      30.5ul
  - 94C 2min, 37C 3min                                                                                             - mix and aliquot 15ul to each tube
  - Add DpnII                                  5ul                                        5 ul
  - 37C 3hr
  - Add                                                                                                    prepare rxn mix for 6.1x
        USER                                   5ul                                        5ul                      30.5ul                   
        10x DpnII buffer                       10ul                                       10ul                     61ul
        H2O                                    85ul                                       85ul                     518.5ul                  
  - 37C O/N                                                                                                        - mix and aliquot 100ul to each tube
  - 75C 20min
  - Purified with four Qiaquick columns
  - Each eluted with 60ul EB (total vol: 4 x 60 = 240ul)
                                            DMR220k_S4                             DMR220k_S5
  USER/DpnII digested DNA conc. (ng/ul)                                                          
  O.D.260/280                                                            
  Yield: conc. x total vol.  ng/ulx492ul= ug                ng/ulx ul = ug