Noi:LabNotes/2010-10-21: Difference between revisions

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==Probe prep for the DMR220k S4 and S5==
(followed Dr. Zhang's conditions)


===Production PCR===
    10nM 1st round amplicon      0.2ul               
    2x Kapa SYBG qPCR Master Mix  50ul       
    100uM pAP1V61U              0.4ul                 
    100uM AP2V6                  0.4ul                     
    H2O                          49ul                         
    ===================================
                                100ul x 96
    95C 30sec
    (95C 3sec -> 55C 30sec-> 60C 20sec) x 15 cycles
    60C 2min 
    15C hold.
   
    - Ethanol precipitation
    - Re-purified with twelve Qiaquick columns
    - Each eluted with 41ul EB (total vol: 12 x 41 = 492ul).
                                            '''DMR220k_S4'''                            '''DMR220k_S5'''
  Amplified amplicon conc. (ng/ul)            194.2                                    192.7                                               
  O.D.260/280                                1.93                                    1.92                           
  Yield: conc. x total vol. 194.2ng/ulx492ul= 95.5ug                192.7ng/ulx492ul = 94.8ug
===Lambda exo digestion===
   
                                            '''DMR220k_S4'''                            '''DMR220k_S5'''
    Qiaquick (QQ)amplified amplicon          108ul (21.0ug)                            108ul (20.8ug)
    10x Lambda Exo buffer                    15ul                                      15ul
    Lambda exo                                10ul                                      10ul
    H20                                      17ul                                      17ul
                                              =====================================================
    Total                                    100ul x 4.5                              100ul x 4.5
    Total amount of QQ amplified amplicon    94.4ug                                    93.6ug
 
    - 37C 1h
    - Purified with four Qiaquick columns
    - Each eluted with 60ul EB (total vol: 4 x 60 = 240ul)
                                            '''DMR220k_S4'''                            '''DMR220k_S5'''                                       
    Single-strand(SS) amplicon conc. (ng/ul)    81.3                                      75.9                                                   
    O.D.260/280                                1.96                                      1.96                               
    Yield: conc. x total vol. 81.3ng/ulx240ul = 19.5ug                  75.9ng/ulx240ul = 18.2ug
===Removal of amplification adaptors===
                                            '''DMR220k_S4'''                            '''DMR220k_S5'''   
  ss-amplicon                                  75ul (6.1ug)                              75ul (5.7ug)
  USER                                        5ul                                        5ul
                                                =======================================================
  Total                                        80ul x 3                                  80ul x 3
  Total amount of ss amplicon                  18.3ug                                    17.1ug
  - 37C 1hr
  - Add
        10x DpnII buffer                      10ul                                      10ul
        100uM RE-DpnII-V66 guide oligo        5ul                                        5ul
  - 94C 2min, 37C 3min
  - Add DpnII                                  5ul                                        5 ul
  - 37C 3hr
  - Add
        USER                                  5ul                                        5ul
        10x DpnII buffer                      10ul                                      10ul
        H2O                                    85ul                                      85ul
  - 37C O/N

Latest revision as of 09:22, 28 October 2010