Jie:LabNotes/CpgSeq/2009-1-13: Difference between revisions

From ZhangLabWiki
Jump to navigation Jump to search
>Jie deng
(New page: ==sequencing library construction (2009-01-13) of BJ, Hybrid_1, Hybrid_2, PGP1F, Hues12== ==2nd PCR amplification with AmpF6.3/AmpR6.3 and dUTP:dNTP 1:40 == reaction system ...)
 
>Jie deng
No edit summary
 
(17 intermediate revisions by the same user not shown)
Line 1: Line 1:
==sequencing library construction (2009-01-13) of BJ, Hybrid_1, Hybrid_2, PGP1F, Hues12==
==sequencing library construction (2009-01-13) of BJ, Hybrid_1, Hybrid_2, PGP1F, Hues12==
  No1: BJ (4.8ng/ul, 09/01/08);
  NO8: Hybrid_1 (4ng/ul, 08/04/08);
  No9: Hybrid_2 (2.8ng/ul, 09/01/08);
  No17: PGPF1 (7ng/ul, 10/10/08);
  No18: Hues12 (6ng/ul, 11/04/08).


==2nd PCR amplification with AmpF6.3/AmpR6.3 and dUTP:dNTP 1:40 ==
==2nd PCR amplification with AmpF6.3/AmpR6.3 and dUTP:dNTP 1:40 ==
   
   
   reaction system                                                x4        x3
   reaction system                                                x4        x5
   H2O                                                43.2ul    172.8ul 518.4
   H2O                                                43.2ul    172.8ul   864
   2x Master mix                                        50ul      200ul     600
   2x Master mix                                        50ul      200ul   1000
   dUTP(1mM)                                            2ul        8ul      24
   dUTP(1mM)                                            2ul        8ul      40
   AmpF6.3(10uM)                                        2ul        8ul      24
   AmpF6.3(10uM)                                        2ul        8ul      40
   AmpR6.3(10uM)                                        2ul        8ul      24
   AmpR6.3(10uM)                                        2ul        8ul      40
   50x SYBG I                                          0.4ul      1.6ul     4.8
   50x SYBG I                                          0.4ul      1.6ul       8
   template(18.4ng/ul)                                0.1ul      0.4ul     1.2
   template(18.4ng/ul)                                0.1ul      0.4ul       2
   Total                                              100ul      400ul    2400
   Total                                              100ul      400ul    2000


   94C 3min -> 13cycles of (94C 45sec -> 55C 45sec -> 72C 45sec) -> 72C 3min -> 4C
   94C 3min -> 13cycles of (94C 45sec -> 55C 45sec -> 72C 45sec) -> 72C 3min -> 4C
    
    
   Bioneer column purification. Yield:167ng/ul x60ul
   Qiaquick column purification.  
  Yield:
  BJ: 28.3ng/ul x30ul;
  Hybrid_1: 37.5ng/ul x 30ul;
  Hybrid_2: 39.1ng/ul;
  PGPF1: 30.7ng/ul;
  Hues12: 35.4ng/ul.


==step2. Digestion with MmeI==
==step2. Digestion with MmeI==
                        dUTP 250uM,167.3ng/ul      x2
                                                    x5
   Total                              20ul      
   Total                              30ul      
   DNA                                 6ul          12 
   DNA                                 20ul           
   10X NEBuffer 4                      2ul          4
   10X NEBuffer 4                      4ul          20
   1mM SAM(fresh)                      2ul          4
   1mM SAM(fresh)                      4ul          20
   2U/ul Mme I                          8ul          16
   2U/ul Mme I                          8ul          40
   ddH2O                                2ul          4
   ddH2O                                4ul          20
    
    
   1mM SAM: 32mM SAM 1ul + 31ul ddH2O.
   1mM SAM: 32mM SAM 1ul + 31ul ddH2O.
   37C 2h
   37C 2h
   MinElute column purify. Elute in 22ul EB.
   MinElute column purify. Elute in 11ul EB.


[[Image:20080801_after MmeI.jpg]]20080801_after MmeI
[[Image:2000914_MmeI.jpg]]2000914_MmeI


==step3. USER digestion==
==step3. USER digestion==
                                   x2
                                   x5
   DNA                    10ul     20ul 
   DNA                    10ul        
   USER                    3ul       6ul  
   USER                    3ul     15ul  
   total                  13ul           
   total                  13ul           


37C 12h.
37C 12h.


==step4. S1 nuclease digestion==
==step4. S1 nuclease digestion (2009-01-13)==
                                     x2
                                     x5
   10 x S1 nuclease buffer:  2ul    4ul
   10 x S1 nuclease buffer:  2ul    10ul
   DNA after USER digestion: 13ul   26ul
   DNA after USER digestion: 13ul    
   S1 nuclease (10U/ul):      1ul    2ul
   S1 nuclease (10U/ul):      1ul    5ul
   ddH2O                      4ul    8ul
   ddH2O                      4ul    20ul


   37C 10mins.
   37C 10mins.
   Minelute cloumn purify. Elute in 18ul H2O.
   Minelute cloumn purify. Elute in 16ul H2O.
 
[[Image:20080801_after USER and S1.jpg]]20080801_after USER and S1


==step5. end repair==
==step5. end repair==
                                     positive control
                                     positive control               x6
   Total                  25ul          H2O 13ul             
   Total                  25ul          H2O 13ul             
   DNA                    15ul            2ul(20080801_spacer_107bp)             
   DNA                    15ul            2ul(20080801_spacer_107bp)             
   dNTP                  2.5ul          2.5ul
   dNTP                  2.5ul          2.5ul                       15
   dATP                  2.5ul          2.5ul    
   dATP                  2.5ul          2.5ul                       15
   10xendrepair buffer  2.5ul          2.5ul
   10xendrepair buffer  2.5ul          2.5ul                       15
   enzyme                0.5ul          0.5ul
   enzyme                0.5ul          0.5ul                       3
   extra ATP(10mM)      2.5ul          2.5ul  
   extra ATP(10mM)      2.5ul          2.5ul                       15


   Keep at room temperature (~25C) for 45 minutes. Purify with Minelute. Elute in 14ul H2O.
   Keep at room temperature (~25C) for 45 minutes. Purify with Minelute. Elute in 14ul H2O.
Line 66: Line 76:
==step6. adapter ligation==
==step6. adapter ligation==
                            
                            
   total                      30ul    positive control    negative control      
   total                      30ul    positive control    negative control   x7 
   DNA                        13ul          13ul            ddH2O 13ul             
   DNA                        13ul          13ul            ddH2O 13ul             
   100uM Solexa_1 adaptor    0.5ul        0.5ul                0.5ul
   100uM Solexa_1 adaptor    0.5ul        0.5ul                0.5ul         3.5
   100uM Solexa_2 adaptor     0.5ul        0.5ul                0.5ul
   100uM Solexa_2_PE adaptor 0.5ul        0.5ul                0.5ul         3.5
   2xQuickLiage buffer        15ul          15ul                  15ul
   2xQuickLiage buffer        15ul          15ul                  15ul         105
   QuickLigase enzyme(NEB)      1ul          1ul                  1ul
   QuickLigase enzyme(NEB)      1ul          1ul                  1ul           7
   extra ATP(10mM)            2.5ul        2.5ul                2.5ul
   extra ATP(10mM)            2.5ul        2.5ul                2.5ul         17.5


   Keep at room temperature (~25C) for 10 minutes. Purify with Minelute cilumn. Elute in 20ul H2O.
   Keep at room temperature (~25C) for 10 minutes. Purify with Minelute cilumn. Elute in 20ul H2O.
[[Image: 20080801_after endrepair and ligation.jpg]]


   PAGE selection 150-175bp. Ethanol precipitation. Elute in 15ul ddH2O.
   PAGE selection 150-175bp. Ethanol precipitation. Elute in 15ul ddH2O.
Line 83: Line 91:
    
    
   set up the ligation system:
   set up the ligation system:
 
                                      x7
   Total                      20ul               
   Total                      20ul               
   DNA                        15ul               
   DNA                        15ul               
   10x ThermoPol buffer        2ul        
   10x ThermoPol buffer        2ul     14     
   10mM dNTP                  0.4ul          
   10mM dNTP                  0.4ul   2.8     
   1mg/ml BSA                  2ul          
   1mg/ml BSA                  2ul     14     
   Bst polymerase(8U/ul)        1ul            
   Bst polymerase(8U/ul)        1ul     7     


   65C for 25 minutes -> keep on ice.
   65C for 25 minutes -> keep on ice.


==step8. PCR of sequencig library==
==step8. PCR of sequencig library==
                                                 x3
                                                 x7
   Nick-translated DNA          10ul              
   Nick-translated DNA          20ul              
   Solexa_PCR_up(10uM)           2ul            6ul  
   Solexa_PCR_upH(10uM)         2ul            14ul  
   Solexa_PCR_lo(10uM)           2ul            6ul
   Solexa_PCR_PE_loH(10uM)       2ul            14ul
   2xiProof master mix          50ul          150ul  
   2xiProof master mix          50ul          1050ul  
   50x SYBG                    0.8ul         2.4ul
   50x SYBG                    0.8ul           5.6ul
   ddH2O                      35.2ul        106.6ul
   ddH2O                      25.2ul        176.4ul
   98C 30sec -> 12 cycles of (98C 10sec -> 65C 20 sec -> 72C 20sec) -> 72C 3min ->15C hold.
   98C 30sec -> 12 cycles of (98C 10sec -> 65C 20 sec -> 72C 20sec) -> 72C 3min ->15C hold.


[[Image:20080803_sequencing library.jpg]]20080803_sequencing library
[[Image:20090120_sequencing library.jpg]]20090120_sequencing library


Purify with Qiaquick column. Elute in 30ul EB.
  Purify with Qiaquick column. Elute in 30ul EB.
yield: 22.9ng/ul(173nM)
  yield:  
  No_1 BJ: 13.7ng/ul(75.4nM) x 30ul
  No_8 Hybrid_1: 15.9ng/ul(87.6nM) x 30ul
  No_9 Hybrid_2: 16.1ng/ul(88.7nM) x 30ul
  No_17 PGPF1: 19.3ng/ul(106nM) x 30ul
  No_18 HUES12: 13.6ng/ul(74.9nM) x 30ul

Latest revision as of 00:30, 31 January 2009

sequencing library construction (2009-01-13) of BJ, Hybrid_1, Hybrid_2, PGP1F, Hues12[edit]

 No1: BJ (4.8ng/ul, 09/01/08);
 NO8: Hybrid_1 (4ng/ul, 08/04/08);
 No9: Hybrid_2 (2.8ng/ul, 09/01/08);
 No17: PGPF1 (7ng/ul, 10/10/08);
 No18: Hues12 (6ng/ul, 11/04/08).

2nd PCR amplification with AmpF6.3/AmpR6.3 and dUTP:dNTP 1:40[edit]

 reaction system                                                x4         x5 
 H2O                                                43.2ul     172.8ul    864
 2x Master mix                                        50ul      200ul    1000
 dUTP(1mM)                                             2ul        8ul      40
 AmpF6.3(10uM)                                         2ul        8ul      40
 AmpR6.3(10uM)                                         2ul        8ul      40
 50x SYBG I                                          0.4ul      1.6ul       8
 template(18.4ng/ul)                                 0.1ul      0.4ul       2
 Total                                               100ul      400ul     2000
 94C 3min -> 13cycles of (94C 45sec -> 55C 45sec -> 72C 45sec) -> 72C 3min -> 4C
 
 Qiaquick column purification. 
 Yield:
 BJ: 28.3ng/ul x30ul;
 Hybrid_1: 37.5ng/ul x 30ul;
 Hybrid_2: 39.1ng/ul;
 PGPF1: 30.7ng/ul;
 Hues12: 35.4ng/ul.

step2. Digestion with MmeI[edit]

                                                   x5 
 Total                               30ul      
 DNA                                 20ul            
 10X NEBuffer 4                       4ul          20 
 1mM SAM(fresh)                       4ul          20
 2U/ul Mme I                          8ul          40 
 ddH2O                                4ul          20 
 
 1mM SAM: 32mM SAM 1ul + 31ul ddH2O.
 37C 2h
 MinElute column purify. Elute in 11ul EB.

File:2000914 MmeI.jpg2000914_MmeI

step3. USER digestion[edit]

                                 x5
 DNA                    10ul         
 USER                    3ul     15ul  
 total                  13ul           

37C 12h.

step4. S1 nuclease digestion (2009-01-13)[edit]

                                   x5
 10 x S1 nuclease buffer:   2ul     10ul
 DNA after USER digestion: 13ul     
 S1 nuclease (10U/ul):      1ul     5ul
 ddH2O                      4ul     20ul
 37C 10mins.
 Minelute cloumn purify. Elute in 16ul H2O.

step5. end repair[edit]

                                   positive control                x6
 Total                  25ul           H2O 13ul             
 DNA                    15ul            2ul(20080801_spacer_107bp)             
 dNTP                  2.5ul           2.5ul                       15
 dATP                  2.5ul           2.5ul                       15
 10xendrepair buffer   2.5ul           2.5ul                       15
 enzyme                0.5ul           0.5ul                        3
 extra ATP(10mM)       2.5ul           2.5ul                       15
 Keep at room temperature (~25C) for 45 minutes. Purify with Minelute. Elute in 14ul H2O.

step6. adapter ligation[edit]

 total                       30ul    positive control     negative control    x7   
 DNA                         13ul          13ul            ddH2O 13ul            
 100uM Solexa_1 adaptor     0.5ul         0.5ul                 0.5ul         3.5
 100uM Solexa_2_PE adaptor  0.5ul         0.5ul                 0.5ul         3.5
 2xQuickLiage buffer         15ul          15ul                  15ul         105
 QuickLigase enzyme(NEB)      1ul           1ul                   1ul           7
 extra ATP(10mM)            2.5ul         2.5ul                 2.5ul         17.5
 Keep at room temperature (~25C) for 10 minutes. Purify with Minelute cilumn. Elute in 20ul H2O.
 PAGE selection 150-175bp. Ethanol precipitation. Elute in 15ul ddH2O.

step7. Nick-translation[edit]

 set up the ligation system:
                                      x7
 Total                       20ul              
 DNA                         15ul               
 10x ThermoPol buffer         2ul     14      
 10mM dNTP                  0.4ul    2.8       
 1mg/ml BSA                   2ul     14       
 Bst polymerase(8U/ul)        1ul      7       
 65C for 25 minutes -> keep on ice.

step8. PCR of sequencig library[edit]

                                               x7
 Nick-translated DNA          20ul             
 Solexa_PCR_upH(10uM)          2ul            14ul  
 Solexa_PCR_PE_loH(10uM)       2ul            14ul
 2xiProof master mix          50ul          1050ul  
 50x SYBG                    0.8ul           5.6ul
 ddH2O                      25.2ul         176.4ul
 98C 30sec -> 12 cycles of (98C 10sec -> 65C 20 sec -> 72C 20sec) -> 72C 3min ->15C hold.

File:20090120 sequencing library.jpg20090120_sequencing library

 Purify with Qiaquick column. Elute in 30ul EB.
 yield: 
 No_1 BJ: 13.7ng/ul(75.4nM) x 30ul
 No_8 Hybrid_1: 15.9ng/ul(87.6nM) x 30ul
 No_9 Hybrid_2: 16.1ng/ul(88.7nM) x 30ul
 No_17 PGPF1: 19.3ng/ul(106nM) x 30ul
 No_18 HUES12: 13.6ng/ul(74.9nM) x 30ul